Новости и мнения

Создание лучшей оптической ловушки

Вскоре после изобретения лазера физик Bell Labs Артур Эшкин начал исследовать ассортимент новых устройств.

Предоставлено Мэтью Дж. Лангом

Вскоре после изобретения лазера физик Bell Labs Артур Эшкин начал исследовать ассортимент новых устройств. Интересно, может ли сила света в луче переместить объект, подобно тому, как палец толкает мяч? Если они это сделают, это подтвердит старую теорию, которая заинтриговала его со времен его учебы в колледже во время Второй мировой войны. «Было известно, что лазер может толкнуть [частицу], вопрос был в том, могли бы вы это наблюдать», – вспоминает Эшкин. Но он обнаружил и еще кое-что: «Когда я это сделал, я обнаружил, что существуют силы, которые притягивают частицы в области высокой интенсивности пучка».

Так родилась концепция «оптического захвата» или «оптического пинцета» – системы лазеров и оптики, которые могут удерживать объекты микрометрового масштаба, устойчивые к броуновскому движению. Эксперименты, проведенные с такими системами, позволили бы нескольким физикам получить Нобелевскую премию, но они были мало полезны для биологов до конца 1980-х годов, когда Стивен Блок, профессор прикладной физики и биологических наук в Стэнфордском университете (тогда в Гарвардском университете), и Говард Берг Профессор физики Херчел Смит в Гарвардском университете использовал их для непосредственного захвата бактериальных клеток для изучения движения жгутиков.

Эти первые набеги начали то, что стало растущей подспециальностью в биофизике, микроманипуляции клеток и биомолекул как способ изучения механики белка. 2 говорит Берг: «Работа над жгутиком кишечной палочки была просто разминкой».

Перенесемся на 20 с лишним лет к февралю прошлого года, когда Блок воспользовался случаем ежегодного собрания Биофизического общества в Лонг-Бич, штат Калифорния, чтобы объявить, что ему удалось составить карту движения РНК-полимеразы с разрешением в один ангстрем. «Это настоящий белок в реальном водном растворе, а не что-то мертвое под микроскопом», – объясняет Блок. «В результате мы смогли разрешить некоторые из самых маленьких движений реального белка, выполняющего свой ферментативный цикл».

Как маленький? При расстоянии между любыми двумя парами оснований менее 3,4 ангстрем Блок мог наблюдать отдельные шаги пары оснований. Сейчас он готовит рукопись по этому исследованию, последней итерации в развитии технологии, которую биофизики используют для выяснения, с все возрастающей ясностью, дискретных молекулярных стадий, через которые проходят белки, когда они выполняют свою работу. Но понять, что делает оптическая ловушка, легче, чем понять, как это происходит. Для этого нужно пойти в физику.

ФИЗИКА 301: КАК ЭТО РАБОТАЕТ

Оптическое улавливание – это всего лишь один из методов, называемых «манипуляторами внешнего поля», которые используют разные силы поля для управления биомолекулами. 3 Иногда эта сила является светом, а иногда – магнитным полем, но по крайней мере в одном памятном случае это была сила тяжести. Исследователь Медицинского института Говарда Хьюза Карлос Бустаманте из Калифорнийского университета в Беркли, который в 1992 году использовал «магнитный пинцет» для выполнения первой прямой манипуляции с одной молекулой, когда он измерил эластичность ДНК, 4 вспоминает этот эксперимент 1991 года: «Наш инструмент была планета Земля “, – говорит он, делая изюминку из ставшего уже классическим эксперимента, в котором его команда прикрепила молекулы ДНК к стеклянному предметному стеклу на одном конце и к микроскопическим шарикам на другом. «По мере того, как мы помещали все больше и больше бусинок на конец ДНК, они погружались в воду дальше и расширяли ДНК, поэтому первое измерение силы-упругости упругости одной молекулы было выполнено гравитационной силой».

Оптические пинцеты используют аналогичные свойства света. Физик девятнадцатого века Джеймс Клерк Максвелл, известный по «уравнениям Максвелла», более века назад предсказал, что очень маленькая сила, называемая «радиационным давлением», должна быть связана с взаимодействием света с материалом. Некоторые исследователи исследовали радиационное давление в начале 20-го века, но только в 1960-х годах появились лазеры, в которых существовали источники света, которые можно было достаточно сфокусировать, чтобы манипулировать очень маленьким объектом.

«Вы можете создавать значительные силы на полистирольном шарике с помощью 60-ваттной лампочки», – отмечает Марк Уильямс, доцент кафедры физики в Северо-восточном университете в Бостоне. «Именно из-за того, что сила воздействует на объект микронного размера, он действительно делает что-то заметное».

Другими словами, оптические ловушки должны бороться с конкурирующими силами. Захват вызван изгибом света, поскольку это преломлено; результирующее изменение импульса фотонов вызывает притяжение шарика к центру лазерной точки. Если свет отражается от поверхности, также происходит изменение импульса в других направлениях, что приводит к выталкиванию бусинки из ловушки.

ВОПРОС ПРАКТИЧНОСТИ

Что действительно делает оптический пинцет практичным лабораторным инструментом, так это способность точно измерять положение при приложении силы. Если вы действительно можете измерить радиационное давление, тогда вы можете точно контролировать силу, чтобы манипулировать веществом, точно так же, как если бы вы работали с механическим инструментом, таким как металлический пинцет. «Локализация и манипулирование являются важной частью», – говорит Ашкин.

ДВА ЧТЕНИЯ ЛУЧШЕ, ЧЕМ ОДИН:

Оптическая схема комбинированного оптического устройства захвата Стивена Блока и флуоресцентного прибора с одной молекулой, показывающая пути света для ртутно-дуговой трансиллюминации (светло-зеленый), лазер захвата (темно-красный), лазер определения положения (оранжевый), лазеры с возбуждением флуоресценции (темно-синий, зеленый) и флуоресцентное излучение (красный). Фотодетекторы включают в себя QPD, аналоговую видеокамеру, цифровую камеру EMCCD и SAPD. Электронные затворы обеспечивают автоматическое управление улавливающим лучом (S1), лучом возбуждения флуоресценции (S2), освещением в ярком поле (S3) и светом, попадающим в EMCCD / SAPD (S4). Несколько оптических фильтров изолируют излучение диодного лазера (F1) и блокируют длины волн ловушки, детектирования и возбуждения лазера до обнаружения флуоресценции (F2-F5). Зеркала Flipper чередуются между видеокамерой и подсистемой SMF (FM1) и выбирают нужный детектор SMF (камера EMCCD или SAPD) (FM2). (От M. Lang et al., Nature Methods, 1: 133–9, 2004.)

© 2004 Nature Publishing Group

По сути, эксперимент с использованием оптического пинцета включает прикрепление биомолекулы к захваченному шарику и вытягивание его. Тогда становится возможным спросить, сколько сил я должен приложить, чтобы диссоциировать комплекс или денатурировать нуклеиновую кислоту? Расстояние, на которое перемещается борт, прямо пропорционально приложенной силе и называется «жесткостью ловушки». Это высокотехнологичное проявление закона Гука, F = -kx, где F – сила, k – жесткость ловушки, а x – смещение.

«Ловушка – это трехмерная пружина, сделанная из света», – объясняет Блок. «Если пружина откалибрована под любую силу, которую вы на нее надавливаете, вы можете использовать ее в качестве измерительного инструмента. Измеряя движения шарика с потрясающей точностью, мы выводим движения молекулы, прикрепленной к шарику».

Конечно, это всего лишь упрощение. «Лучевая оптика работает отлично, если длина бусинки больше длины волны света», – говорит Уильямс. «С бусинками порядка длины волны света вы должны думать о градиентной силе из-за электрического поля на диэлектрике, что приводит к более сложным вычислениям».

Не существует такого понятия, как «универсальная» установка оптических пинцетов, потому что лидеры отрасли постоянно совершенствуют метод. Существуют, например, конфигурации с одним, двумя и несколькими пучками, чьи разные геометрии создают разные силы на захваченных шариках. 56 Например, с помощью двух лучей вы можете работать дальше от объектива и, таким образом, работать глубже в растворе.

Хотя у каждого магнитного и оптического пинцета есть свои уникальные преимущества и недостатки, по словам Бустаманте, грубый способ различать их заключается в том, какой метод лучше всего работает с каким уровнем силы. Магнитный пинцет работает лучше всего при очень низких усилиях, под пиконьютоном (pN). Оптический пинцет лучше всего подходит для сил от 1 до 100 пН. Атомно-силовая микроскопия также используется в экспериментах с одной молекулой; это лучше всего для сил от 100 пН до 1 наноньютона.

Мара Прентисс из Гарвардского университета говорит, что ее лаборатория больше концентрируется на магнитных пинцетах, которые значительно упрощают копирование экспериментов. «Большинство оптических пинцетов удерживают только одну частицу за раз», – пишет она по электронной почте. «Дэвид Грир из [Нью-Йоркского университета] сделал пинцет, который несколько заманивает в ловушку, и мы также поймали несколько, но это трудно сделать сотню или тысячу и иметь разумную глубину ловушки».

НЕ ПОПРОБУЙТЕ ЭТО НА ДОМЕ

Несколько компаний, таких как Cell Robotics из Альбукерке, N.Mex. И PALM Microlaser Technologies из Бернрида, Германия, предлагают готовые оптические пинцеты. Но большинство исследовательских лабораторий взламывает свои собственные. Однолучевая лазерная система захвата на уровне обучения может быть создана за несколько тысяч долларов. «Это всего лишь объектив микроскопа и объектив», – говорит Уильямс о системе стоимостью 4000 долларов, которую он создал из оптических деталей и одномодового лазерного диода. «Вам не нужен окуляр, если вы работаете с лазерами», – добавляет он.

Такая система может задерживать бактерии и дрожжи, даже отдельные молекулы. Но если вы надеетесь удивить их в Биофизическом обществе, вам понадобится полностью настроенная комбинация оптики, пьезоэлектрических каскадов и лазеров с компьютерным управлением, которые вместе стоят шесть цифр, и более чем вероятно время постдока с блоком или Бустаманте. , Джефф Геллс, профессор Брандейского университета и сотрудник Block’s, говорит, что он отправляет своих студентов в лабораторию Block в Стэнфорде для экспериментов, которые требуют очень точно откалиброванных измерений.

В лабораторном эквиваленте зачистки Lexus для деталей, некоторые лаборатории строят свои системы, выпирая и модифицируя высококачественные оптические микроскопы. Другие просто строят свои собственные системы с нуля. Мэтью Лэнг, доцент кафедры биологической инженерии в Массачусетском технологическом институте, полагает, что одним из преимуществ использования стандартного микроскопа является то, что он знаком с внешними сотрудниками и может упростить такие основные операции, как загрузка образцов.

Эластичные гены?

Этот оптический пинцет с двумя лучами используется для растяжения ДНК. Два лазерных луча фокусируются в одном и том же месте объективами микроскопа, захватывая полистирольную сферу. Чтобы растянуть ДНК, еще одна полистирольная сфера удерживается на конце стеклянной микропипетки с помощью всасывания. Когда молекула ДНК растягивается при перемещении микропипетки, она воздействует на захваченную сферу, заставляя ее слегка двигаться. Расстояние, которое он перемещает, пропорционально силе, оказываемой растяжением. Результирующая измеренная сила раскрывает информацию об эластичности молекулы, ее стабильности и взаимодействии с окружающей средой.

Предоставлено Mark C. Williams

Исследовательские инструменты имеют целые подсистемы, предназначенные для определения положения (определения смещения). И, по словам Блока, не исключено, что на нем есть инструмент с пятью или более источниками света. «Один для захвата, один для определения положения, другой для возбуждения флуоресценции, и, возможно, один для другого цвета возбуждения флуоресценции, плюс ртутная дуговая лампа для освещения».

Задачей эксперимента Блока с разрешением в один ангстрем была чрезвычайная стабильность прибора. «Если ваша система дрейфует, вы начинаете измерять свою систему, но не интересующий вас объект», – говорит Блок. «Вы измеряете, что что-то движется, но не энзим… Реальный ключевой момент заключается в том, что вам нужна сверхстабильная система, лишенная дрейфа».

Он объясняет основную физическую проблему: «Если вы распространяете лазерный луч по воздуху, лазерный луч немного мерцает. Он движется вверх и вниз крошечными, крошечными величинами, и это происходит по той же причине, что звезда мерцает; потому что есть колебания плотности в воздухе, и колебания плотности вызывают изменение в показателе преломления, и они действуют немного как линза, чтобы изогнуть луч света “. Обычно в световой микроскопии флуктуации плотности слишком малы, чтобы быть проблемой, но на уровне ангстрема это не так. Блок говорит, что его лаборатория “за последние несколько лет достигла крайностей в создании системы, которая не подвержена дрейфу”.

По словам Блока, одно, казалось бы, очевидное решение – поместить все инструменты в вакуум, создает свои собственные сложные, громоздкие проблемы, поэтому его команда сделала следующее лучшее: они использовали гелий, у которого показатель преломления гораздо ближе к показателю вакуума чем воздух, так небольшие изменения давления не погнут свет.

«Используя рассеянный свет, мы можем измерить центр одной из гранул намного меньше, чем предел разрешения светового микроскопа, либо с помощью интерферометрии, либо с обнаружением задней фокальной плоскости», – говорит Блок.

Том Перкинс, научный сотрудник JILA, исследовательского института в Боулдере, штат Колорадо, который работает совместно с Национальным институтом стандартов и технологий и Университетом Колорадо, применил другой подход к достижению разрешения с единичным ангстремом. 7 В отличие от системы Блока, которая была отсоединена от поверхности покровного стекла для уменьшения собственного шума, Перкинс использовал второй лазер для измерения поверхностного шума, а затем вычел его в режиме реального времени. «Если вы можете настроить анализ, в котором вы можете собрать все это с поверхности, то метод Стива – очень хороший выбор, – говорит Перкинс, – но для анализов, которые по своей природе связаны с поверхностью, наш будет работать лучше».

ФЛУОРЕСЦЕНЦИЯ И БУДУЩЕЕ

Хотя большая часть биохимии одной молекулы была достигнута с помощью оптических ловушек, существуют другие способы решения этих проблем. Один включает точный мониторинг флуоресцентных зондов, например, на поверхности молекулярного двигателя.

Некоторые исследователи в настоящее время создают сложные системы, которые объединяют такие измерения с оптическим захватом. Японец Тошио Янагида сделал новаторскую работу в 1998 году, используя микроструктурированный пьедестал, чтобы отделить оптические ловушки от места флуоресценции, чтобы избежать фотообесцвечивания. Совсем недавно Блок и Лэнг, его бывший постдок, продемонстрировали, что возможно совмещать захват и флуоресценцию в одном и том же месте и на одной и той же молекуле. 8

Комментируя различные методы манипулирования отдельными молекулами, от оптических ловушек до магнитных пинцетов до атомно-силовой микроскопии, Хулио Фернандес из Колумбийского университета говорит: «Приборостроению предстоит пройти долгий путь, но в конце этого пути он собирается революционизировать нашу понимание белков. Это изменит способ написания книг “.

Обсуждение

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *