Новости и мнения

Самое точное редактирование генов CRISPR

Измененная нуклеаза Cas9 снижает нецелевые эффекты до уровней ниже, чем в предыдущих версиях фермента.

To minimize the off-target effects of CRISPR-based genome editing, researchers have designed a version of Cas9, the enzyme that cuts DNA, that avoids mistakes with unprecedented precision. Чтобы минимизировать нецелевые эффекты редактирования генома на основе CRISPR, исследователи разработали версию Cas9, фермента, который разрезает ДНК, который позволяет избежать ошибок с беспрецедентной точностью. Мутация одного фрагмента нуклеазы, называемой REC3, снижает нежелательные эффекты до уровня ниже, чем у других высокоточных ферментов Cas9.

«Если вы мутируете определенные аминокислотные остатки в REC3, вы можете изменить баланс между активностью Cas9 на мишени и улучшенной специфичностью», – говорит соавтор Дженис Чен, аспирант лаборатории Дженнифер Дудна в Калифорнийском университете в Беркли, выпуск «Мы смогли найти приятное место, где есть достаточная активность в отношении намеченной цели, но также значительное сокращение нецелевых событий»

Чен и ее коллеги решили понять, почему некоторые варианты Cas9, а именно, eSpCas9 (1.1) и SpCas9-HF1, более специфичны для их целевых последовательностей и делают меньше срезов вне цели, чем естественная версия. Именно тогда они определили роль REC3 в определении точности, с которой фермент связывается с намеченным отрезком ДНК: в случае несоответствия, как обнаружила команда, REC3 будет сохранять Cas9 неактивным.

«Используя это наблюдение, мы разработали новый сверхточный вариант Cas9 (HypaCas9), который демонстрирует высокую специфичность по всему геному без ущерба для целевой активности в клетках человека», – пишут авторы в своем исследовании, опубликованном в среду (20 сентября) в Nature. ,

Когда они протестировали этот новый HypaCas9 на шести целевых сайтах, исследователи обнаружили, что на двух сайтах нуклеаза не допускала ошибок, на трех сайтах она делала одну ошибку, и для одного сайта она попала в 18 непреднамеренных локусов. Для сравнения, у Cas9 дикого типа был идеальный результат только один раз, и в других случаях он составлял от восьми до 134 нецелевых эффектов, в зависимости от предполагаемого места. Два более специфичных варианта Cas9 работали так же хорошо, как HypaCas9 для пяти сайтов, но имели несколько дополнительных ошибок на шестом.

«Мы обнаружили, что даже незначительные изменения в домене REC3 Cas9 влияют на разницу между редактированием как на цели, так и вне цели, что говорит о том, что этот домен является очевидным кандидатом для глубокого мутагенеза для улучшения специфичности таргетинга», – говорит Чен в релиз. «В качестве продолжения этой работы можно выполнить более непредвзятый мутагенез в рамках REC3, чем сделанные нами целевые мутации».

Обсуждение

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *