Новости и мнения

Обсуждение инструмента обнаружения РНК разгорается на конференции ACS

Исследователи отмечали несколько проблем с так называемыми SmartFlares на протяжении многих лет, и до сих пор неясно, почему они не работают при определенных обстоятельствах.

На недавнем собрании Американского химического общества в Бостоне в прошлом месяце продолжалось разногласие по поводу конкретного инструмента для обнаружения и визуализации РНК в живых клетках, называемого SmartFlares, который достиг предела. В какой-то момент Чад Миркин , химик из Северо-Западного университета, который помогал в разработке этой методики, назвал «критика» Рафаэля Леви , биохимика из университета Ливерпуля, «научным террористом».

«Это, конечно, не та культура и атмосфера, которые способствуют дискуссии и решению этих очень важных вопросов», – говорит Леви. Миркин не стал комментировать инцидент.

Спор о SmartFlares продолжается уже много лет. Инструмент, который стал коммерчески доступным MilliporeSigma в 2013 году, обнаруживает РНК в живых клетках.

Есть более 40 работ, сообщающих об успешном использовании таких структур.

Чед Миркин, Северо-Западный университет

Идея SmartFlares проста: зонды проникают в клетки посредством эндоцитоза, каждый из которых состоит из наночастиц золота, прикрепленных к олигонуклеотиду, который кодирует последовательность-мишень. Зонд содержит флуорофор, который не излучает флуоресценцию, пока он находится в непосредственной близости от золотого ядра. Но когда зонд встречает свою РНК-мишень, это сместит флуорофор и заставит его светиться.

Научное сообщество изначально охватило исследования. Например, в 2013 году он занял место в Топ-10 инноваций года, выбранных независимой комиссией.

Но, по словам Леви, зонды не работают.

Побег из эндосомы

Теория Леви заключается в том, что когда частицы попадают в клетки, они попадают в ловушку эндосомальных компартментов внутри клетки и не попадают в цитоплазму там, где они должны находиться для обнаружения РНК. Этот вывод основан на его собственной экспериментальной работе , говорит он.

Именно этот момент вызвал жаркую дискуссию во время встречи в августе. По словам посетителя, который попросил остаться анонимным, чтобы избежать причастности к спору, Леви и Миркин были спорными после презентации Миркина. Но на третий вопрос Леви – «Сколько из вспышек действительно уходит из эндосом?» – Миркин, как сообщается, расстроился, и обмен стал неприятным.

Вейбо Цай , доцент кафедры биомедицинской инженерии в Университете Висконсин-Мэдисон, присутствовавший на презентации Миркина, говорит, что он не считает жаркую дискуссию «большой проблемой» и не вспоминает об имени, говорит он Ученому в электронном письме. «Я думаю, что они, вероятно, имели дебаты много раз прежде», добавляет он.

Миркин не согласен с оценкой Леви в отношении захвата эндосом. «Нарциссический подход Леви сродни« я купил самолет и не могу заставить его летать ». Поэтому самолеты не летают, несмотря на то, что я вижу их всех над собой », – говорит он Ученому .

Миркин подчеркивает количество исследований, в которых зонды были успешно использованы: «Нет никаких противоречий. , , Существует более 40 статей, в которых сообщается об успешном использовании таких структур, в которых участвуют более 100 различных исследователей, охватывающих три разных континента », – пишет он в электронном письме The Scientist . «Я думаю, что данные и широкое использование таких структур говорят об их надежности и полезности для измерения содержания РНК в живых клетках», – добавляет он.

Тем не менее, несколько исследователей отметили проблемы с инструментом в последние годы по разным причинам.

Отзывы пользователей

Алехандра Пера, аспирант по иммунологии в Университете Кордовы, говорит, что у нее были трудности с тем, чтобы ее клетки с самого начала брали на себя исследования. Во время эксперимента четыре года назад она хотела иметь возможность изучать некоторые микроРНК, связанные с воспалением в клетках естественных киллеров (NK), с помощью проточной цитометрии. «Однако наши исследования привели нас к выводу, что NK-клетки не захватывают зонды, даже положительный контроль, который должен захватывать [d] все клетки», – пишет она в электронном письме The Scientist .

С тех пор MilliporeSigma отозвала с рынка все датчики SmartFlare.

Пера говорит, что, когда она связалась с MilliporeSigma, компания объяснила ей, что эти конкретные ячейки не проницаемы для зондов SmartFlare, о которой она не подозревала. Затем она попробовала Т-клетки, но с ними тоже не достигла хороших результатов.

Санджай Тяги (Sanjay Tyagi) , который работает над другим методом визуализации РНК в Медицинской школе Rutgers в Нью-Джерси, говорит, что использование клеточных технологий является одной из проблем при разработке таких инструментов. По этим причинам он вводит в клетки различные зонды, известные как молекулярные маяки, напрямую. «Хотя должно быть легко обнаружить РНК – просто создайте флуоресцентный олиго, дополняющий последовательность РНК, – на практике существует ряд проблем», – пишет он в электронном письме. Однако он отмечает, что сам не проверял SmartFlares.

По словам Свена Будика, биолога из Университета ветеринарной медицины в Вене, зонды SmartFlare разработаны с учетом устойчивости к перевариванию нуклеазными ферментами из-за звездообразной сборки комплементарной ДНК. В прошлом году он использовал инструмент для исследования гендерно-специфических мРНК у ранних зародышей лошади. По его словам, хотя камеры и занимались исследованиями, он был разочарован результатами.

«Сначала это выглядело хорошо из-за флуоресценции, но потом мы поняли, что это может быть не конкретный сигнал», – говорит Будик. Используя просвечивающий электронный микроскоп, он заметил, что подавляющее большинство частиц SmartFlare оставалось в лизосомах клеток, где они вызывали флуоресценцию. Он считает, что наиболее вероятным объяснением является то, что они разрушаются там ферментами, а не попадают в цитоплазму. «Я очень разочарован этим [не] работой, потому что это было бы отличным инструментом для этой цели», – говорит он.

Джоанна Берета , биохимик из Ягеллонского университета в Кракове, также столкнулась с трудностями несколько лет назад, когда она хотела получить инструмент, позволяющий различать клетки, экспрессирующие определенный вид мРНК, и клетки, которые этого не делают. Она выяснила, почему инструмент не работал, в конце концов опубликовав статью об этом в прошлом году в Scientific Reports .

«В нашей работе мы не наблюдали никакой корреляции между сигналами пяти разных зондов SmartFlare и уровнями их целевых мРНК, измеренными с помощью КПЦР, даже там, где различия в уровнях мРНК были огромными», – пишет она в электронном письме The Scientist .

SmartFlares покидают рынок

С тех пор MilliporeSigma отозвала с рынка все датчики SmartFlare.

Линейка продуктов была прекращена, потому что она «не оправдала наших ожиданий», – пишет в электронном письме пресс-секретарь MilliporeSigma Карен Тиано . «Как и в области биологии, проекты наших заказчиков были нюансированы, и со временем мы обнаружили, что технология лучше всего подходит для применения в стволовых клетках». Она отмечает, что обнаружение РНК в живых клетках остается многообещающим направлением исследований.

К сожалению, для ее исследования, добавляет Берета, существует несколько инструментов для обнаружения и визуализации РНК в живых клетках. «Большинство существующих методов количественного определения РНК основаны на фиксации или лизисе клеток», – пишет она.

Исследователь в этой области, который попросил не называть его имени, чтобы избежать спора, говорит, что подход с использованием покрытых ДНК наночастиц золота в целом все еще имеет свои достоинства и заслуживает дальнейшего внимания исследователей. Однако, добавляет он, полемика вокруг коммерчески доступного инструмента затруднила исследователям изучение этого подхода к обнаружению ДНК.

«Я думаю, что все должны понимать, что нездоровая дискуссия приводит к неудачным заявкам на финансирование, а судьи указывают, что в этом вопросе есть противоречие. Рефери заявления такие. , , в условиях жесткой конкуренции за финансирование просто истощите финансирование этой темы », – пишет он в электронном письме The Scientist. Он считает, что недавняя заявка на получение гранта по этой теме была отклонена по этой причине, добавляет он.

«Вместо того, чтобы атаковать новую технологию, лучше попытаться понять все ее технические аспекты с помощью исследований», – говорит источник. «Это единственный способ разработки новых коммерческих продуктов, которые принесут пользу людям».

Исправление (5 сентября): в предложении, касающемся ответа Мерк, пропущено «нет» . Ученый сожалеет об ошибке.

Обновление и исправление (7 сентября): Мы добавили комментарий от MilliporeSigma об удалении SmartFlares с рынка. Мы также исправили статью, чтобы сказать MilliporeSigma, а не Merck. Ученый сожалеет об ошибке.

Обсуждение

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *