Новости и мнения

Новая техника ограничивает мутации CRISPR-Cas9 вне цели

ASTRAZENECA

Исследование на мышах детализирует метод, называемый VIVO, который предсказывает точность любой направляющей РНК.

Одним из препятствий, мешающих использованию редактирования гена CRISPR-Cas9 в клинике, является возможность того, что фермент будет обрезать ДНК в неправильном месте. В исследовании, опубликованном в Nature   сегодня (12 сентября)   Исследователи описывают стратегию для предсказания этих нецелевых мутаций по всему геному и показывают на мышах, что тщательно разработанная направляющая цепь РНК не приводит к заметным проскальзываниям.

Исследование подтверждает, что «вам лучше убедиться, что у вас есть действительно точная направляющая РНК», – говорит Джанет Россант , биолог-разработчик из Университета Торонто и больницы для больных детей, которые не участвовали в работе. «Этот [метод] является лучшим способом проверки того, насколько специфичной будет РНК, прежде чем вы перейдете к моделям на животных и, конечно же, к людям», – добавляет она.

По словам соавтора Marcello Maresca , биолога из AstraZeneca в Швеции, одной из долгосрочных целей его компании является возможность использовать редактирование терапевтических генов для лечения ряда заболеваний человека. «Однако реализация потенциала лекарств CRISPR требует разработки методов, позволяющих эффективно модифицировать ген-мишень без каких-либо эффектов в других местах генома», – пишет он в электронном письме The Scientist.

Вне цели сокращения могут происходить в геномном месте, где они не влияют на организм, или они могут нарушать основные клеточные функции. Пытаясь предсказать места, где Cas9 может пойти не так, исследователи часто начинают с компьютерных предсказаний, но они полагаются на предположения о том, как их направляющая РНК будет связывать ДНК и как разрезает Cas9.

«Интересно увидеть метод экспериментального определения отклонения от цели, поскольку в этом подходе отсутствует предвзятость, представленная нашими предположениями о том, что является вероятным отклонением от цели», – говорит Кейт О’Коннор-Джайлс , нейробиолог из Университета Брауна, который не участвовал в учеба.

Чтобы разработать метод минимизации нецелевых эффектов, группа Марески объединила усилия с командой Дж. Кейта Чжуна , биолога и патолога из Гарвардского университета и Массачусетской больницы общего профиля. Первая часть подхода исследователей, первоначально разработанная группой Joung и опубликованная в 2017 году, происходит in vitro. Сначала они срезают геномную ДНК – в текущем исследовании они использовали геномы мыши – на куски примерно из 300 пар оснований, а затем прикрепляют серию адаптеров, которые циркулируют ДНК. Они вводят нуклеазу Cas9 и направляют комплекс РНК, который расщепляет кольцевую ДНК в некоторых местах, линеаризуя ее.

Это дает вам возможность оценить, дают ли ожидаемые результаты изменения, которые вы вносите в стратегию для повышения специфичности.

-J. Кит Джунг, Гарвардский университет

Другая партия нуклеаз разрушает оставшуюся кольцевую ДНК, которая не была разрезана. Таким образом, исследователи могут упорядочить линеаризованную ДНК, чтобы увидеть, где Cas9 сделал свои разрезы – как предназначенные, так и непреднамеренные – и предсказать, приведет ли эта направляющая РНК к нецелевым эффектам in vivo.

Для второй части стратегии, разработанной в последнем исследовании, авторы проверили свой прогноз на мышах. Когда они использовали направляющую РНК, которую они обнаружили in vitro, отсекали тысячи неправильных мест в геноме, более 40 процентов предсказанных сайтов подмножества, которые они проверяли, также мутировали в печени мыши. Чем чаще сайт появлялся на экране in vitro, тем больше вероятность его мутации in vivo. Другими словами, направляющая РНК, которая была небрежной in vitro, была также небрежной in vivo.

Команда также проверила пятна в геноме мыши из экспериментов in vivo, которые были предсказаны в вычислительном отношении как возможные нецелевые сайты, но не были обнаружены на экране in vitro. Они не обнаружили мутации в этих местах, что означает, что их метод in vitro, вероятно, не пропустил истинные цели.

Что касается другой направляющей РНК, которая, как ожидали исследователи, будет высокоспецифичной для сайта-мишени, они не выявили обнаруживаемых мутаций in vivo ни на одном из 182 предсказанных сайтов.

«Настоящим достижением является практическая способность выявлять специфические для организма отклонения от целей, а не полагаться на эталонную последовательность генома, которая не обязательно отражает генетический контекст организма, с которым вы работаете, или, в случае клинических условий пациент », – говорит О’Коннор-Джайлс. Поскольку для скрининга in vitro можно использовать геномную ДНК конкретного пациента или организма, показания на этапе секвенирования отражают возможные цели Cas9 в геноме субъекта.

«Это [исследование] должно способствовать дальнейшему развитию терапии на основе in vivo», – говорит Чжун. «Это также обеспечивает важный план или путь вперед для того, как можно смотреть на эти потенциальные цели вне цели в контексте целого организма или в условиях in vivo. И это важно, потому что – особенно в исследовательских целях – это дает вам возможность оценить, дают ли ожидаемые результаты изменения, которые вы вносите в стратегию для повышения специфичности ».

P. Ackakaya и соавт., «Редактирование CRISPR in vivo без детектируемых мутаций вне мишени в геноме», Nature , doi: 10.1038 / s41586-018-0500-9, 2018.

Обсуждение

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *