Новости и мнения

Когда Цинковые Пальцы Мисс Марка

Две новые методики определяют, как часто нуклеазы цинковых пальцев расщепляют нецелевые сайты.

Цинковые нуклеазы спроектированы так, чтобы быть похожими на тепловыделяющие ракеты, точно предназначенные для поиска и разрезания определенных последовательностей ДНК. Иногда, однако, они могут поразить не то место, вызывая непреднамеренные перерывы. Две публикации, опубликованные сегодня (7 августа) в журналах Nature, описывают способы систематического поиска таких нецелевых действий, которые однажды могут помочь в разработке генной терапии, которая позволит избежать побочного повреждения.

«До этого времени не было действительно всеобъемлющего способа определения специфичности нуклеазы цинкового пальца», – сказал Карлос Барбас , химический биолог из Исследовательского института Скриппса в Ла-Холья, Калифорния, который не принимал участия в исследовании. «Поскольку мы начинаем лечить пациентов с нуклеазами цинкового пальца и модифицировать геномы, нам необходимо знать, где производятся эти модификации».

Цинковые пальцы, названные так потому, что их структура напоминает руку с заостренным пальцем, связываются с различными трехбуквенными нуклеотидными последовательностями. Объединив несколько цинковых пальцев и добавив ДНК-расщепляющую нуклеазу, исследователи могут точно нацелиться на конкретные гены, которые нужно разрезать. Такая специфичность повышает возможность разработки генной терапии нуклеазы цинкового пальца (ZFN). Действительно, фармацевтическая компания Sangamo Biosciences тестирует кандидата на лечение ВИЧ в испытаниях на безопасность человека, которые используют ZFN для модификации рецептора Т-клеток CCR-5, который ВИЧ использует для проникновения в клетку.

Но это не идеальная система: иногда молекула может связывать и обрезать другую, почти идентичную последовательность ДНК, потенциально убивая клетки.

Чтобы систематически охарактеризовать эти нецелевые сайты расщепления, химический биолог из Гарварда Дэвид Лю и его коллеги протестировали два ZFN против библиотеки из 100 миллиардов фрагментов ДНК, некоторые из которых присутствуют в геноме человека. Чаще всего нуклеазы расщепляют целевой сайт. Но они иногда вырезали и другие подобные последовательности, включая один ген, связанный с сигнальным путем рака.

«Поверхностная интерпретация нашей статьи может привести к пессимизму в отношении нуклеаз цинкового пальца, но на самом деле я настроен оптимистично», – сказал Лю. В дополнение к подтверждению того, что количество разрывов вне цели уменьшалось при более низких концентрациях ZFN, исследователи обнаружили, что использование ZFN, которые менее активно связываются с последовательностью-мишенью, по-видимому, имеет меньше непреднамеренных разрывов, сказал он. Это говорит о том, что может быть возможно разработать терапию ZFN таким образом, чтобы минимизировать эти нецелевые эффекты. Исследователи опубликовали свои результаты в журнале Nature Methods .

Во втором исследовании, опубликованном в Nature Biotechnology , исследователи дозировали клетки лейкемии человека ZFN, который разрезает рецептор CCR-5. Они идентифицировали места среза путем трансфекции клеток мечеными вирусными частицами, которые связывались с сломанными концами ДНК, и обнаружили, что в целом ZFN связывается с целевой ДНК CCR-5. Приблизительно 1 в 20000 раз, однако, он расщеплял второй рецепторный ген, почти идентичный по последовательности, а также несколько других подобных последовательностей еще реже. Но исследователи использовали чрезвычайно высокую концентрацию ZFN и использовали линию клеток, которая очень благоприятна для действия ZFN, чтобы увидеть, какой будет наихудший сценарий, сказал соавтор Филипп Грегори , главный научный сотрудник Sangamo BioSciences. Низкий уровень нецелевого сокращения даже в этих условиях «подтверждает наши ожидания, что белки будут чрезвычайно специфичными», и предполагает, что гораздо более низкие медицинские дозы, применяемые в клинике, почти никогда не будут вызывать нецелевые сокращения, сказал он ,

По словам Барбаса, эти методы могут быть когда-нибудь использованы на ранней стадии разработки лекарств для отбора кандидатов с наилучшей специфичностью. Однако неясно, насколько всеобъемлющими являются новые тесты ZFN, сказал он. Например, метод меченых вирусных частиц может пропускать нецелевое расщепление, поскольку вирусные метки могут не связываться с каждым разрывом. Кроме того, добавил Барбас, в отличие от ДНК в пробирке, клеточная ДНК плотно наматывается на хроматин, поэтому многие из сайтов связывания, обнаруженных методом пробирки, могут быть защищены от ZFN и никогда не разрезаться в живых клетках.

Таким образом, хотя новые тесты могут стать ключевыми инструментами для ранней разработки лекарств, полная картина появится только тогда, когда можно получить всю последовательность генома человека за 1000 долларов, сказал он, когда исследователи смогут тестировать людей, получающих лечение ZFN для каждого нецелевого перерыва. ,

R. Gabriel, et. al., «Беспристрастный геномный анализ специфичности нуклеазы цинковых пальцев», Nature Biotechnology , doi: 10.1038 / nbt.1948, 2011.

V. Pattanayak, et. al., «Выявление нецелевых особенностей расщепления нуклеаз цинкового пальца путем отбора in vitro», Nature Methods, doi: 10.1038 / nmeth.1670, 2011.

Обсуждение

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *