Новости и мнения

Хранение CRISPR в проверке

В геномах бактериофага исследователи обнаружили три белка против CRISPR, которые естественным образом ингибируют CRISPR-Cas9 у одного вида бактерий и могут делать то же самое в клетках человека.

A team of scientists that previously identified genes within bacteriophage genomes that code for anti-CRISPR proteins has now discovered phages that harbor an antidote to the Cas9 enzyme that is a key component of the predominant CRISPR system that is today used as a gene-editing tool. Команда ученых, которые ранее идентифицировали гены в геномах бактериофага, которые кодируют анти-CRISPR белки, теперь обнаружили фаги, которые несут антидот к ферменту Cas9, который является ключевым компонентом преобладающей системы CRISPR. это сегодня используется в качестве инструмента редактирования генов. Команда под руководством Алана Дэвидсона из Университета Торонто описала три закодированных бактериофагом гена anti-Cas9 и показала, что соответствующие белки способны блокировать активность CRISPR-Cas9, полученного из бактериальных систем CRISPR-Cas типа II, в клетки человека. в газете. Работа группы, опубликованная на прошлой неделе (8 декабря) в Cell , может помочь исследователям лучше понять естественные системы CRISPR и лучше модулировать работу инструментов редактирования генов на основе CRISPR для исследований и клинических применений .

Примечательно, что работа «идет специально после Cas9, а затем применяет открытия в человеческих клетках», – пишет Джордж Гарчард из Гарварда, который не принимал участия в исследовании, в электронном письме The Scientist.

«Идентификация тех долгожданных анти-CRISPR белков для систем типа II началась с классических поисков in silico, основанных на сходстве последовательностей с уже известными анти-CRISPR белками», – Филипп Хорват , старший научный сотрудник DuPont во Франции, который впервые показал, что CRISPR Система обеспечивает устойчивость к фагам у прокариот, и которые также не участвовали в исследовании, пишет в электронном письме The Scientist . «Что менее тривиально в этой работе и действительно хитроумно, так это итеративная комбинация поисков сходства последовательностей и генетического анализа контекста, предсказывающая, что аналоги анти-CRISPR типа II должны быть найдены в эквивалентных местах в совершенно не связанных последовательностях».

С 2013 года Дэвидсон и его коллеги первоначально обнаружили пять генов, которые кодируют фаговые белки, которые блокируют активность системы IF CRISPR типа. Затем они провели идентификацию еще девяти фаговых белков, ингибирующих системы IFIS и IE CRISPR, все они находятся в геномах протеобактерий.

Для настоящего исследования исследователи расширили свой поиск, чтобы идентифицировать последовательности в бактериальных разновидностях, ища дополнительные анти-CRISPR белки, закодированные в бактериальных геномах. Команда снова искала последовательности с гомологией к aca1 и aca2, двум генам, кодирующим предполагаемые регуляторы транскрипции, которые ранее были обнаружены рядом с генами анти-CRISPR.

Исследователи обнаружили предполагаемый анти-CRISPR белок, кодируемый в геноме Brackiella oedipodis, который содержит систему CRISPR типа II-C, которая включает Cas9. Поскольку известно, что Neisseria meningitides, ответственные за некоторые типы менингита у людей, имеют систему CRISPR-Cas типа II, Davidson и его коллеги показали, что гены анти-CRISPR на плазмиде, трансформированные в N. meningitidis, могут блокировать клетки. Система II типа CRISPR-Cas. Затем они идентифицировали одного гомолога анти-CRISPR B. oedipodis, а также двух дополнительных анти-CRISPR в геноме N. meningitidis .

Исследователи обнаружили, что очищенные анти-CRISPR белки из N. meningitidis взаимодействуют с очищенным Cas9 из того же вида in vitro. Смешивание Cas9, ДНК-мишени и РНК с одним направителем и – необходима точная активность по разрезанию ДНК Cas9 – с одним из белков анти-CRISPR предотвратили порезы двухцепочечной ДНК.

Белок анти-CRISPR также работал в клетках человека. Когда команда трансфицировала клетки человека в культуре плазмидами, кодирующими Cas9, направляющую гены РНК и анти-CRISPR белок, недавно обнаруженный белок был способен блокировать Cas9 от редактирования генома. Используя человеческие культивируемые клетки, экспрессирующие дезактивированную форму Cas9, которая связывается с ДНК, но не может создать двухцепочечный разрыв, исследователи обнаружили, что белок анти-CRISPR предотвращает связывание Cas9 с его геномным сайтом, определенным РНК.

«Все три [анти-CRISPR] белка связываются с Cas9 по-разному, чтобы блокировать активность фермента по расщеплению ДНК», – сказал Дэвидсон. В настоящее время его лаборатория работает над тем, чтобы понять, как эти белки взаимодействуют с Cas9 для предотвращения его активности. «Мы ожидаем, что будет намного больше анти-CRISPR против других систем CRISPR», – сказал он.

«Очевидный интерес к анти-CRISPR белкам, которые ингибируют системы типа II, заключается в возможности модулировать активность Cas9 в приложениях для редактирования генов», – написал Хорват. «Экспрессия этих ингибирующих белков может быть инициирована в ответ на данное состояние или в определенный момент времени в развитии организма, что остановит активность Cas9. Умный способ хранить молекулярный скальпель в его защитном футляре ».

По словам Черча, особенно интригующим потенциальным применением анти-CRISPR являются генные двигатели , разрабатываемые для борьбы с комарами и другими переносчиками болезней.

На данный момент настоящее исследование расширяет понимание ученых об иммунитете, связанном с взаимодействием между бактериями и их вирусами. «Из всех наших исследований [по этим анти-CRISPR белкам] мы пришли к выводу, что у фага есть сильное эволюционное преимущество в получении этих анти-CRISPRs», – сказал Дэвидсон.

«Знания о том, как работают анти-CRISPR белки, также имеют отношение к другим применениям систем CRISPR-Cas… Знание того, как вирусный враг уклоняется от иммунитета, основанного на CRISPR, даст ценную информацию о способах лучшей борьбы с [вирусами]», – написал Хорват.

A. Pawluk и др., «Естественные выключатели для CRISPR-Cas9», Cell, doi: 10.1016 / j.cell.2016.11.017, 2016.

Обсуждение

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *