Новости и мнения

Экран CRISPR определяет функциональную регуляцию генов

Метод, основанный на CRISPR-Cas9, исследует регуляторные роли некодирующих последовательностей ДНК.

Большая часть ДНК не белки. И выяснить, как, когда и где эта геномная «темная материя» играет роль в регуляции генов, – огромное дело. Теперь ученые разработали инструмент, который мог бы помочь. В статье, опубликованной сегодня (3 апреля) в Nature Biotechnology , команда из Университета Дьюка в Дареме, Северная Каролина, описывает высокопроизводительную методику скрининга, которая использует редактирование эпигенома CRISPR-Cas9 для идентификации регуляторных элементов в геномах клеток человека.

«Оказывается, что большая часть генетических вариаций, ответственных за более распространенные сложные заболевания, такие как сердечно-сосудистые заболевания, диабет и неврологические расстройства, на самом деле происходит в этом регионе между генами», – сказал соавтор Чарльз Герсбах из Duke. «Увлекательным является наличие методов, позволяющих аннотировать функцию некодирующего генома», – добавил он.

«Некодирующий геном огромен, и может быть сложно определить, какие области важны для модуляции кодирующих белок генов», – написал Невилл Санджана из Нью-Йоркского университета, который не принимал участия в исследовании, в электронном письме The Scientist . Это исследование «использует объединенную технологию скрининга CRISPR, чтобы помочь нам выяснить, где находятся функциональные области в некодирующем геноме», объяснил он.

Gersbach с коллегами создали лентивирусные библиотеки направляющих РНК для нацеливания на вероятные регуляторные элементы в нескольких мегабазах ДНК, окружающих два представляющих интерес локуса: β-глобин и HER2. Затем они создали клеточные линии с интегрированным флуоресцентным белком, чтобы сообщить об активации целевого гена.

Авторы трансдуцировали свои клеточные линии одним из двух вариантов белка Cas9 с дезактивированной нуклеазной активностью, названным dCas9. Репрессорная форма dCas9 рекрутирует белки, которые метилируют лизин 9 на гистоне H3, что приводит к образованию гетерохроматина и репрессии генов в последовательностях-мишенях. Активирующая форма dCas9 связывается с целевыми энхансерами или промоторами ДНК и способствует ацетилированию лизина 27 на гистоне Н3, что приводит к активации гена.

Затем исследователи преобразовали свои клеточные линии с библиотеками направляющих РНК на низких уровнях, чтобы гарантировать, что одна направляющая РНК будет присутствовать в каждой клетке. Затем они сортировали клетки по флуоресценции и секвенировали направляющую РНК, присутствующую в клетках с особенно высокой и низкой экспрессией гена-мишени.

Идентификация последовательностей подтвердила известные регуляторные элементы и выявила новые роли для других последовательностей ДНК. Многие, хотя и не все, из этих последовательностей появлялись как на экранах активатора, так и на репрессоре. И некоторые последовательности, по-видимому, играют регуляторную роль для гена в одном типе клеток, но не для того же гена в другом типе клеток. Хотя наблюдаемые изменения в экспрессии генов были незначительными, авторы подтвердили регулирующую роль отдельных последовательностей ДНК.

«Мы знаем, что есть несколько аспектов эпигенома, которые очень сильно коррелируют с изменениями в регуляции генов, и всегда было трудно превратить эти наблюдения в реальное понимание того, как на самом деле регулируются гены», – сказал соавтор Тим Редди из Duke . Ученый.

«Мы еще не знаем, является ли конкретная эпигенетическая модификация, которую мы наблюдаем, причинной», – сказал Редди. «Но теперь мы знаем из этого, а также из других работ наших лабораторий и других, что модификация эпигенома действительно играет роль в регуляции некоторых из этих генов-мишеней».

Ричард Шервуд из Бригамской и женской больниц в Бостоне, который не принимал участия в исследовании, сказал, что эта методика скрининга может помочь исследователям интерпретировать большие объемы геномных данных, которые были получены в рамках таких проектов, как ENCODE . «Это захватывающе: чем больше инструментов у нас в наборе инструментов, тем больше разных вопросов мы можем решать», – сказал Шервуд.

Редди, Герсбах и их коллеги работают над расширением техники скрининга, чтобы изучить возможные регуляторные элементы во всем геноме для разных типов клеток и тканей. Они также планируют использовать технику в попытках лучше понять определенные заболевания.

«Есть так много мест, где мы знаем, что генная регуляция способствует болезни», – сказал Редди. «Теперь мы можем начать получать действительно четкое представление о механизмах, вызывающих эти заболевания, и сами эти механизмы могут стать путём терапии. Эти механизмы могут помочь лучше диагностировать, они могут помочь дифференцировать пациентов, которые делают или не реагируют на терапию, [и] которые могут помочь лучше лечить пациента ».

TS Klann et al., «Редактирование эпигенома CRISPR-Cas9 позволяет проводить высокопроизводительный скрининг функциональных регуляторных элементов в геноме человека», Nature Biotechnol., Doi: 10.1038 / nbt.3853, 2017.

Обсуждение

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *