Новости и мнения

Достижения в редактировании генома

Исследователи разрабатывают технику на основе CRISPR, которая эффективно исправляет точечные мутации без расщепления ДНК.

Most genetic diseases in humans are caused by point mutations—single base errors in the DNA sequence. Большинство генетических заболеваний у людей вызваны точечными мутациями – единичными ошибками в последовательности ДНК. Тем не менее, современные методы редактирования генома не могут эффективно исправить эти мутации в клетках и часто вызывают случайные вставки или делеции нуклеотидов в качестве побочного продукта. Теперь исследователи из Гарвардского университета модифицировали технологию CRISPR / Cas9, чтобы обойти эти проблемы, создав новый «базовый редактор», описанный сегодня (20 апреля) в Nature , который постоянно и эффективно преобразует цитозин (C) в урацил (U). с низкой ошибкой в ​​клеточных линиях человека и мыши.

«Существует много генетических заболеваний, в которых вы, по сути, хотели бы менять базы между собой», – сказал Джейкоб Корн , научный директор Инициативы по инновационной геномике в Университете Калифорнии, Беркли, который не принимал участия в исследовании. , «Попытка заставить это работать – одна из больших проблем в этой области, и я думаю, что это действительно захватывающий подход».

На сегодняшний день подходы к редактированию генома CRISPR / Cas9 основаны на клеточном механизме, называемом гомологичной репарацией, который запускается двухцепочечными разрывами в ДНК. Исследователи снабжают клетки матрицей, содержащей желаемую последовательность, делают целенаправленный разрыв двухцепочечного фермента Cas9, а затем ждут, чтобы убедиться, что гомологически направленное восстановление включает матрицу для повторного соединения цепей. К сожалению, этот метод неэффективен (включение является редким) и часто вносит новые ошибки в виде случайных индексов во время разрыва, что делает его непрактичным для терапевтической коррекции точечных мутаций.

Поэтому исследователи из Гарварда во главе с химиком и химическим биологом Дэвидом Лю попробовали другой подход. Во-первых, они инактивировали часть Cas9, так что она не могла сделать двухцепочечный разрыв. Затем они связали Cas9 с ферментом, называемым цитидин-деаминазой, который непосредственно катализирует превращение С в U (по существу эквивалент тимина Т) без расщепления ДНК. Посылка этого механизма в клетки создает несоответствующую пару в цели, включающую недавно введенный U, и оригинальное основание гуанина (G) на противоположной цепи. «Это [несоответствие] искажает ДНК», – объяснил Лю. «Это создает забавную маленькую выпуклость, которая не выглядит нормальной».

Выпуклость предупреждает другой механизм восстановления клеток, несоответствие восстановления, которое удаляет одну из несовпадающих оснований и заменяет ее дополнением к оставшейся. Без какой-либо информации о том, какая база неверна, исправление несоответствия приводит к желаемому преобразованию G в A примерно в 50% случаев; в остальное время он преобразует U обратно в C.

Но исправление несоответствия действительно включает дополнительную информацию, когда она доступна: она обнаруживает крошечные разрывы в основной цепи ДНК, называемые никами. «Клетки развили механизм устранения несоответствия, чтобы расставить приоритеты старой ДНК над вновь синтезированной ДНК», – сказал Лю. «Недавно синтезированная ДНК имеет тенденцию иметь некоторые зазубрины в этом. Поэтому мы рассуждали, что можем манипулировать исправлением несоответствия, чтобы способствовать исправлению нити ДНК, которая нам не нужна, а именно нити, содержащей G. »

Команда снова модифицировала Cas9, на этот раз, чтобы она создала ник в неотредактированной G-содержащей цепи, оставив при этом отредактированную U-содержащую цепь нетронутой. «Теперь ячейка говорит:« Ага, здесь есть несоответствие, и причиной ошибки должна быть буква G, потому что это должна быть вновь синтезированная цепь, потому что в ней есть ник », – сказал Лю. «Это будет предпочтительно исправить это G, используя другую цепь в качестве шаблона».

Используя технику в шести локусах в клетках человека, команда сообщила, что целевая базовая скорость коррекции составляет до 37 процентов, и только около 1 процента последовательностей показывают инсалы. В отличие от этого, обычная техника редактирования Cas9, протестированная на трех из этих локусов, показала эффективность менее одного процента и формирование инделей более чем на четыре процента. Исследователи также продемонстрировали потенциал этой техники для исправления связанных с болезнью мутаций путем преобразования варианта APOE , гена, связанного с болезнью Альцгеймера, в версию с более низким риском в клетках мыши.

«Создавая этот Cas9, они нашли действительно хороший способ обмануть камеру, выбрав пути, которые она обычно не предпочитает», – сказал Корн. Тем не менее, поскольку метод в настоящее время способен конвертировать только пары оснований CG в UA (то есть TA) и в некоторых случаях редактирует другие основания C в непосредственной близости от цели, «это определенно не панацея», предупредил он. «Это не значит, что теперь вы можете вылечить любое генетическое заболевание. Но, вероятно, найдется немало тех, кто вписывается в эту категорию ».

Tudor Fulga из Оксфордского университета назвал эту технику «чрезвычайно гениальной идеей», чтобы обойти неэффективное восстановление, направленное на гомологию, и уменьшить нежелательное образование инлей. «Я думаю, что это приведет к смене парадигмы в этой области», – сказал он The Scientist . «Весьма вероятно, что влияние редактирования базы, опосредованного Cas9, будет огромным – как с точки зрения ответов на вопросы фундаментальных исследований, так и в терапевтических приложениях, основанных на геномной инженерии».

В Nature сегодня также появляются два исследования, посвященные потенциальной альтернативе Cas9: ферменту Cpf1 . CRISPR / Cpf1 создает «липкие концы» – выступы в расщепленной ДНК, которые оставляют непарные основания по обе стороны от разлома, а не тупые концы, сделанные в результате расщепления двухцепочечной ДНК Cas9.

Эммануэль Шарпантье и его коллеги из Института биологии инфекции Макса Планка в Германии показали, что, в отличие от Cas9, Cpf1 обрабатывает РНК в дополнение к расщеплению ДНК. Тем временем Чживэй Хуан из Харбинского технологического института, Китай, и его коллеги описали кристаллическую структуру CRISPR / Cpf1.

«Липкие концы более эффективны [чем тупые концы] для восстановления ДНК в клетках», – сказал Хуанг The Scientist. «Мы считаем, что [понимание] структуры Cpf1 поможет нам не только узнать механизм работы Cpf1, но и разработать более конкретные и более эффективные инструменты редактирования генома».

Д. Донг и др., «Кристаллическая структура Cpf1 в комплексе с РНК CRISPR», Nature , doi: 10.1038 / nature17944, 2016.

I. Fonfara et al., «CRISPR-ассоциированный ДНК-расщепляющий фермент Cpf1 также обрабатывает предшественник CRISPR РНК», Nature , doi: 10.1038 / nature17945, 2016.

AC Komor et al., «Программируемое редактирование базы-мишени в геномной ДНК без расщепления двухцепочечной ДНК», Nature , doi: 10.1038 / nature17946, 2016.

Обсуждение

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *